بررسی پایداری حرارتی آنزیم آلفا آمیلاز حاصل از باسیلوس kr8104 با استفاده از موتاسیون هدفمند

برای استفاده کارآمد از آلفا- آمیلازها این آنزیم ها باید در دماهای بالا پایدار بوده و فعالیت خود را حفظ کنند. یکی از دلایل غیر فعال شدن حرارتی برگشت ناپذیر آنزیم ها، ایجاد تغییرات کووالان نظیر دآمیداسیون اسید آمینه های آسپارژین و گلوتامین می باشد. اسیدهای آمینه آسپارژین در دماهای بالا ممکن است دستخوش تغییر شیمیایی نظیر جدا شدن گروه آمین شوند. در این مطالعه آلفا- آمیلاز جدا شده از سویه ایرانی باسیلوس kr8104 که bka نامیده می شود مورد بررسی قرار گرفت. انتخاب اسیدهای آمینه آسپارژین به منظور ایجاد جهش با تمرکز بر ساختار کریستالی پروتئین انجام شد. با توجه به ساختار سه بعدی پروتئین 6 اسید آمینه آسپارژین که انتظار می رفت بطور بالقوه قابلیت دآمیده شدن داشته باشند انتخاب شده و بوسیله موتاسیون هدفمند به اسیدهای آمینه دارای بار مثبت، بار منفی و قطبی بدون بار تغییر یافتند. به این ترتیب 16 جهش یافته مختلف ایجاد شده و میزان پایداری حرارتی هر کدام پس از انکوبه کردن در دمای بالا مورد بررسی قرار گرفت. در مقایسه با آنزیم وحشی 4 آنزیم جهش یافته توانستند پایداری پروتئین را در دمای بالا افزایش دهند. بیشترین پایداری در مورد جایگزینی n112d مشاهده گردید که سبب افزایش نیمه عمر پروتئین به میزان 5 برابر در دمای c° 70 شده بود. همچنین جایگزینی های n112e، n129d و n312s نیز توانستند پایداری پروتئین را به طور قابل توجهی افزایش دهند. در مرحله بعد به منظور افزایش بیشتر پایداری پروتئین، 5 جهش یافته حاوی 2 جهش و یک موتانت دارای 3 جهش ساخته شده و پایداری حرارتی آنها مورد بررسی قرار گرفت. موتانت دارای دو جهش n112d/ n129d بیشترین میزان پایداری را داشته و نیمه عمر این آنزیم در مقایسه با آنزیم وحشی حدود 9 برابر افزایش یافت. علاوه بر نیمه عمر پروتئین ها دیگر پارامترهای مرتبط با پایداری نظیر t50 و tm نیز اندازه گیری شدند. نتایج نشان دادند که جایگزینی های انجام شده اثرات مطلوبی در بهبود پایداری حرارتی آنزیم bka ایجاد کرده اند.